摘要：为研究发酵方式对葎草总黄酮含量及其抗氧化活性的影响，分别进行对照组、自然发酵组和乳酸菌发酵 组试验。以芦丁为标准品测定草提取液中总黄酮的含量，通过草总黄酮稀释液对 1，1-二苯基-2-三硝基 苯肼（DPPH）和 2，2’-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）自由基的清除率来评价其抗氧化活性。研 究结果表明：乳酸菌发酵组总黄酮含量显著高于对照组和自然发酵组（P ＜0.05）。草总黄酮稀释液质量浓 度为 1.0 mg ／mL 时，乳酸菌发酵组对 DPPH 自由基的清除率显著高于对照组和自然发酵组（P ＜0.05 ），对 ABTS 自由基的清除率显著高于自然发酵组（P ＜0.05）。草总黄酮稀释液质量浓度为 0.2 ～0.4 mg ／mL 时， 自然发酵组对 ABTS 自由基的清除率显著高于对照组和乳酸菌发酵组（P ＜0.05）。发酵处理后草中总黄酮 的含量及其抗氧化活性均有明显变化。
关键词：自然发酵；乳酸菌发酵；葎草；总黄酮；抗氧化活性
引言
葎草（Humulus scandens）不但含有蛋白质和脂肪等多种营养成分，而且含有黄酮类、多糖类、胆碱、 鞣质及树脂等多种活性成分[1] 。文献[2]在研究草提取物的抗菌作用时，发现草提取液具有较强 的抗菌活性，证实其抗菌作用与草中所含的黄酮类成分有关。黄酮类化合物中含有柚皮苷[3] 和少量 野漆树苷[4] ，具有抗菌消炎、增强机体免疫力[5 -6] 、提高抗氧化能力[7 -9] 、延缓衰老、调节代谢机能、促进 动物生长等作用[10 -12] 。植物中一般含有较多的细胞壁成分，这些成分会对营养成分及活性成分形成包 埋作用，影响营养物质的利用和活性物质功能的发挥。植物经微生物发酵以后，通过微生物自身的代谢 活动，能够将植物中具有致密结构的纤维素等大分子物质降解成可以被动物利用的小分子物质，破坏细 胞壁成分的致密结构，释放被束缚的营养物质及活性物质，提高其生物利用率[13] 。文献[14]利用乳酸 菌发酵法水解大豆异黄酮，可使游离型大豆异黄酮含量增加。文献[15]利用黑曲霉对野生草提取液 进行发酵，得到了草总黄酮的最优提取条件。文献[16]利用黑曲霉对草提取液进行发酵，其产物 的再抑菌性能提升。目前，对草进行直接发酵的相关研究较少。自然发酵不需要特异菌种，操作更加 简便，但能否达到与乳酸菌发酵相同的效果还不能确定。因此，本文旨在研究乳酸菌发酵和自然发酵对 草总黄酮含量及其抗氧化活性的影响，可为草在畜牧生产中的有效开发和科学利用提供一定的理 论依据。
1 试验
2017 年 4 月底，在河南科技大学周山校区动物科技学院动物牧场随机采集展叶期新鲜全株葎草， 去除杂草、杂物，60 ℃烘干制成半干样品，粉碎过 30 目筛后装入自封袋内保存，备用。
1 .1 样品处理
试验将备用葎草草粉随机取 30 份，随机分 10 份为对照组、10 份为自然发酵组、10 份为乳酸菌发酵组。对照组不发酵，直接进行测定。
自然发酵组：取适量的烘干样品，用蒸馏水按料液质量比 1 ∶2 混合均匀，于广口瓶内压实填满，密 封厌氧发酵 15 d，取出烘干，以备检测分析。
1 .2 葎草总黄酮的提取
分 3 次称取 5 g 两种发酵完成的草半干样品，以不发酵的半干样草粉末为对照组，按质量浓度 0.067 g ／mL，以 75％（体积分数）无水乙醇为有机溶剂，80 ℃水浴锅中水浴提取 2 h，趁热过滤，回收提 取液。将每次所得的 3 种不同处理方式的草提取液分开定容后做好标记，待恢复至室温后，置于冰箱 中冷冻保存，即为备测提取液。
1.3 标准曲线的制备
文献[18]研究发现波长 5 10 nm 时总黄酮吸光度最大，因此，在波长 5 10 nm 处测定草总黄酮的 吸光度。以吸光度为横坐标（X），对照组总黄酮质量浓度为纵坐标（Y），使用芦丁为标准品，绘制标准 曲线。
1 .4 葎草总黄酮含量的测定及计算
取 3 mL 不同处理组的草总黄酮提取液，定容于 25 mL 容量瓶中，测定不同处理组 5 10 nm 波长下 的吸光度，利用回归方程计算出不同处理组的总黄酮提取量，即为总黄酮含量。
1.5 葎草总黄酮稀释液浓度梯度的制备
使用草总黄酮提取液配制成质量浓度分别为 0.2 mg ／mL、0.4 mg ／mL、0.6 mg ／mL、0.8 mg ／mL、 1.0 mg ／mL的对照组草总黄酮稀释液，冷藏备用。自然发酵组草总黄酮稀释液和乳酸菌发酵组 草总黄酮稀释液均按对照组的质量浓度梯度操作配制。
1 .6 D PPH 自由基清除率的测定
1.8 统计分析
用 Microsoft Excel 软件对数据进行统计并作预处理，再用 SPSS 17.0 统计软件进行方差分析，采用最小显著性差异（least significant difference，LSD）t 检验法对各组间平均数进行多重比较，各组试验结果 数据均以均数 ±标准差表示。
2 结果与分析
3 讨论
3.1 发酵对葎草提取液中总黄酮含量的影响
本文利用发酵技术对葎草草粉进行自然发酵和乳酸菌发酵，并以未发酵的葎草为对照组。结果表明：乳酸菌发酵组总黄酮含量远高于对照组与自然发酵组。由于添加乳酸菌，保证发酵过程中乳酸菌成 为优势菌群。发酵过程中，微生物经自身的代谢活动产生各种酶，特别是其中的纤维素酶能够将植物中 结构紧密的细胞壁成分进行分解或转化，可以有效释放活性物质，从而使总黄酮含量提高，与文献报道 结果一致。文献[19]研究表明：黄芪叶片中总黄酮的含量相对较高，其次为茎和根，经发酵后根、茎部 位的总黄酮含量略有提高。文献[20]的研究结果表明：添加乳酸菌可以提高青贮苜蓿中黄酮的含量。 相对而言，自然发酵组的总黄酮含量和对照组的总黄酮含量差异不显著。对照组葎草黄酮含量比自然 发酵组的高，其原因是在自然发酵的过程中，微生物对细胞壁成分和结构分解释放出来的黄酮有限。同 时，在自然发酵中，由于葎草自身携带的微生物种类和数量比较复杂，而这些复杂微生物分泌的酶对黄 酮等活性物质分解作用更大，造成自然发酵后草中黄酮的量反而低于对照组。说明不同的发酵方式 会影响葎草的总黄酮含量。
3.2 发酵对葎草总黄酮稀释液抗氧化活性的影响
试验结果表明：不同处理组葎草总黄酮稀释液对 DPPH 自由基和 ABTS 自由基都具有较好的清除 作用，经发酵处理后的葎草总黄酮的抗氧化活性均有明显变化。不同处理组葎草总黄酮稀释液对 DPPH 自由基清除率随着总黄酮质量浓度的升高而提升。文献[21]运用分光光度法检测了山楂中总黄 酮对 DPPH 自由基和超氧阴离子自由基的清除能力，得到山楂中的总黄酮具有明显的抗氧化能力的结 论。文献[22]以比色法测定中药材大血藤中总黄酮的含量，并做了一系列抗氧化活性的测试，结果发 现大血藤提取物中具有较强抗氧化物质，可以有效清除 DPPH 自由基。文献[23]用超声提取法提取葎草中的总黄酮，结果表明，葎草中黄酮类物质以最高抗氧化性的形式存在，其结构容易被氧化，所以黄酮 类化合物具有比较强的抗氧化活性，能够很好地保护细胞膜上的不饱和脂肪酸免于被氧化[24 -25] 。但经 自然发酵后，葎草总黄酮稀释液对 DPPH 自由基的清除率低于对照组，与部分相关报道结果一致。文献 [26]的研究结果表明：未发酵桑叶 70％（体积分数）乙醇提取物的抗氧化活性整体优于液体发酵后的 抗氧化活性。不同处理组葎草总黄酮稀释液对 ABTS 自由基的清除率随着总黄酮质量浓度升高而提 升，其中，自然发酵组葎草总黄酮稀释液对 ABTS 自由基的清除率最高，与部分相关报道结果一致。文 献[27]研究结果表明：经自然发酵后的芒果和木瓜具有较好的抗氧化活性和清除 ABTS 自由基的能力， 且抗氧化活性基本呈上升趋势。葎草黄酮类化合物作为自由基吸收剂，可以有效地清除植物体内一部 分因衰老而产生的自由基，是葎草中黄酮类化合物与微量元素协同作用的结果。发酵改变了葎草黄酮 的种类和结构，但不同的种类和结构的黄酮清除 DPPH 自由基和 ABTS 自由基的能力差异较大。
4 结束语
经乳酸菌发酵后葎草总黄酮含量提升十分明显，但自然发酵后葎草总黄酮含量的提升效果并不理 想。通过发酵处理后，葎草总黄酮稀释液的抗氧化能力均有明显变化，在对 DPPH 自由基和 ABTS 自由 基清除能力上表现出了不同的结果。发酵后草总黄酮稀释液对 DPPH 自由基的清除能力基本呈减弱 的趋势，而对 ABTS 自由基清除能力基本呈增强的趋势，但均以自然发酵组表现最为明显，其中的科学 原因有待进一步研究。
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