摘要:为了筛选斯氏副柔线虫抗原基因用于血清学诊断和免疫防治研究,对斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj-CPR基因序列进行了生物信息学分析,RT-PCR扩增获得了Pj-CPR基因,构建重组表达质粒pETCPR后,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中并诱导表达获得重组蛋白rCPR。SDS-PAGE和Westernblot检测结果表明,重组蛋白rCPR大小为17.6ku,主要以包涵体的形式表达,能与感染斯氏副柔线虫的骆驼血清中IgG特异性结合,具有良好的抗原活性,可用于斯氏副柔线虫病血清学诊断方法和免疫防控研究。
关键词:斯氏副柔线虫,半胱氨酸蛋白酶,原核表达,骆驼
斯氏副柔线虫病是由斯氏副柔线虫(Parabronemaskrjabini)寄生于骆驼、牛、羊等反刍动物真胃引起的一种寄生虫病,尤以骆驼感染较为严重[1-3]。大量虫体寄生可导致患畜真胃发生炎症、出血及溃疡,严重者造成骆驼死亡,对养驼业危害极大,是危害我国养驼业的一种主要寄生虫病,给农牧民带来了巨大的经济损失。因此,对斯氏副柔线虫病的监测和诊断是骆驼寄生虫病防控中的重点。
由于骆驼多分布在第三世界国家的落后地区,所以时至今日,国内外关于斯氏副柔线虫病的研究相对滞后,主要是关于分类和传播媒介的研究[4-6]。在骆驼斯氏副柔线虫病的防控上,目前存在的主要问题是缺少针对该病的系统的基础理论研究、缺乏有效的生前诊断方法和防治的新方法。适用于许多寄生性线虫的粪便虫卵检查法可用于该病的诊断,但检出率非常低,很难用于临床实践。该病的诊断主要依靠死后剖检(在真胃查找虫体),此类诊断方法不能为早期治疗提供参考。在实际生产中,往往是在没有诊断依据的情况下盲目地给药驱虫,造成经济损失的同时也带来了诸如毒副作用、出现耐药虫株及畜产品兽药残留超标等诸多弊端。
因此,本研究在斯氏副柔线虫转录组测序分析的基础上[7],筛选出了半胱氨酸蛋白酶Pj-CPR基因作为候选抗原基因,对其进行功能注释,生物信息学分析,并对该基因进行了克隆、原核表达和抗原性验证。研究结果可为该病的血清学诊断方法和免疫防控研究奠定基础。
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1 虫体、血清、质粒与菌株斯氏副柔线虫采自内蒙古巴彦淖尔市乌拉特后旗骆驼体内,液氮中保存;斯氏副柔线虫病骆驼阳性血清、阴性血清均采自内蒙古巴彦淖尔市乌拉特后旗;pMD19-Tsimplevector,Takara公司产品;表达载体pET30a(+),Invitrogen公司产品;大肠埃希菌DH5α、BL21(DE3),北京全式金生物技术有限公司产品。
1.1.2 主要的酶和试剂总RNA提取试剂RNAisoPlus、PrimerScriptTMRTreagentKit、DNAATailingKit,宝生物工程(大连)有限公司产品;质粒小提试剂盒,DNA凝胶回收试剂盒,AXYGEN公司产品;BCAProteinassaykit、Ni-NTASefinoseTMResinKit、限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、PrimeSTAR®GXLDNAPolymerase、DNAT4连接酶,上海生工生物工程技术服务有限公司产品;化学发光(ECL)底物显影液,ThermoScientific公司产品;辣根过氧化物酶标记的兔抗骆驼IgG,由上海生工生物工程技术服务有限公司制备。
1.2 方法
1.2.1 Pj-CPR基因生物信息学分析利用生物信息学软件对斯氏副柔线虫转录组测序得到的Pj-CPR基因进行生物信息学分析。用ExPASy(http://web.expasy.org/translate/)和ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)软件预测开放阅读框,SignalIP4.1server(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在线软件进行信号肽序列预测;SecretomeP.2.0server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/)软件进行非典型蛋白分泌物预测;TMHMMserver.v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)软件进行跨膜蛋白结构域分析;TargetP1.1server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)软件预测真核生物蛋白亚细胞定位;BepiPred1.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)软件进行抗原表位预测。
1.2.2 Pj-CPR基因的扩增及克隆测序根据斯氏副柔线虫转录组测序中半胱氨酸蛋白酶Pj-CPR基因序列设计1对引物并分别在上游引物和下游引物中引入EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位点。上游引物:5′-CGGAATTCATGAAACGTTCCCTCCTC-3′,下游引物:5′-CCGCTCGAGTTCATATGTTTCTTCACC-3′,引物由华大基因有限公司合成
参照RNAisoPlus说明书提取斯氏副柔线虫总RNA,利用反转录试剂盒(PrimerScriptTMRTreagentKit)合成cDNA,再以RNA反转录产物为模板,PCR扩增目的基因。PCR反应条件为:94℃5min;94℃30s,57℃30s,72℃90s,35个循环;最后72℃10min。PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物经纯化后,与pMD19-Tsimplevector连接,连接产物转化大肠埃希菌DH5α,PCR及EcoRⅠ/XhoⅠ质粒双酶切鉴定为阳性的菌株由华大基因公司进行双向测序。
1.2.3 原核表达载体的构建从测序结果正确的菌株中提取克隆质粒(命名为pMD-CPR),将pMDCPR和表达载体pET30a(+)分别用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切后,以凝胶回收试剂盒回收目的基因和载体片段,用T4DNA连接酶连接构建Pj-CPR基因原核表达载体(命名为pETCPR)并转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞。在含卡那霉素的固体LB培养基培养后,挑取单菌落分别进行质粒电泳、PCR和质粒双酶切鉴定,阳性菌株送华大基因公司进行序列测定。
1.2.4 重组菌的诱导表达及诱导条件的优化重组表达菌BL21(pETCPR)用1.0mol/LIPTG诱导表达后,经超声波裂解菌体,离心收集超声上清和超声沉淀,SDS-PAGE检测重组蛋白的表达形式。
采用不同诱导剂浓度、不同时间及不同温度诱导重组表达菌,SDS-PAGE电泳分析,确定最佳诱导条件。Pj-CPR基因重组表达菌诱导培养后,收集菌体,以溶菌酶和超声波法裂解菌体,离心收集包涵体沉淀,用8mol/L尿素溶解,再离心收集上清液,以0.45μm孔径滤器过滤后,按照上海生工Ni-NTASefinoseTMResinKit步骤纯化重组蛋白。
1.2.5 重组蛋白的Westernblot检测重组蛋白经SDS-PAGE分离后,转移至硝酸纤维素膜上。用含50g/L脱脂奶粉的封闭液于室温封闭3h;以骆驼斯氏副柔线虫病阳性血清(1∶1000)为一抗,同时设阴性血清对照;以辣根过氧化物酶标记的兔抗骆驼IgG为二抗(1∶5000),用ECL超敏显影液显色进行Westernblot检测。
2结果
2.1Pj-CPR基因生物信息学分析
通过ExPASy和ORFfinder在线软件对PjCPR基因进行特征性分析,结果显示,Pj-CPR基因核酸序列长度为291bp,蛋白分子质量为11.93ku,含有一个编码97个氨基酸的完整ORF,其中有强酸氨基酸14个,强碱氨基酸14个,疏水氨基酸26个和极性氨基酸34个,等电点为7.304。
用SignalP和SecretomeP软件对基因编码蛋白的信号肽序列进行预测和非典型分泌蛋白分析,结果Pj-CPR存在信号肽序列,且SecretomeP软件预测中NN-Score=0.860,属于分泌蛋白(图1)。用BepiPred软件预测基因编码蛋白抗原表位,结果表明,Pj-CPR蛋白存在5个抗原表位,分别为STGNTNELE(aa20-28)、LG(aa39-40)、EQLR(aa42-45)、QYSKPDADANL(aa57-67)、ERYKRGEETYE(aa87-97),表明Pj-CPR编码的分泌性蛋白具有较好抗原性。
用TMHMM和TargetP软件对基因进行蛋白跨膜区预测和蛋白亚细胞定位分析,并分析跨膜蛋白中氨基酸在胞外区、跨膜区和胞内区的数量。结果显示,Pj-CPR不是跨膜蛋白,且整个蛋白均位于胞外(图2);在TargetP软件预测中由于信号肽的存在,该蛋白也被定位到分泌途径中。
2.2目的基因的克隆及重组表达质粒的鉴定
以斯氏副柔线虫RNA反转录产物为模板,采用特异性引物对Pj-CPR基因进行扩增,经琼脂糖凝胶电泳检测,结果表明,获得了约291bp的特异性条带,与预期大小相符(图3)。经PCR鉴定为阳性的重组表达菌,提取质粒经EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切,得到了约291bp的片段,表明Pj-CPR基因已插入到表达载体pET30a(+)上(图4)。
2.3序列分析
将斯氏副柔线虫Pj-CPR基因克隆载体和表达载体测序结果同转录组测序基因序列进行比较。结果表明,Pj-CPR基因序列与转录组测序的序列完全一致,说明成功构建了该基因的原核表达载体。
2.4重组菌诱导表达
重组表达菌BL21(pETCPR)经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE电泳检测,与BL21(DE3)空菌和空载体转化菌BL21(pET30)相比,出现了特异性目的基因融合蛋白表达带,与预期结果一致(图5)。分析其超声上清和超声沉淀,目的蛋白绝大部分在沉淀中,表明目的蛋白主要是以包涵体的形式表达(图6)。
5重组蛋白Westernblot分析
重组Pj-CPR蛋白(简称rCPR)Westernblot结果表明,重组蛋白rCPR与阳性血清在17.6ku处出现了特异性显色带,阴性血清对照在相应位置无显色条带(图7)。说明rCPR能够与斯氏副柔线虫感染骆驼血清中的IgG特异性结合,具有较好的免疫活性。
3讨论
高通量测序分析技术是近年来发展起来的一种高效的研究手段,促进了生物学研究领域的快速发展[8]。在寄生虫的研究上,也得到了广泛的应用[9-10],寄生虫的一些分泌性蛋白同源物,如氨肽酶类、蛋白酶类及毒性分泌物等,被认为是与寄生虫免疫相关的抗原蛋白,具有免疫原性,在寄生虫免疫调节、免疫逃避及寄生虫与宿主互作中起关键作用[11-14]。这些功能性抗原可以为筛选疫苗抗原、发掘药物靶点及确定诊断抗原提供依据[15-16]。目前,国内外未见关于斯氏副柔线虫病免疫学诊断和免疫防控的研究报道。本研究所选的半胱氨酸蛋白酶Pj-CPR基因是在斯氏副柔线虫转录组和蛋白质组学分析的基础上,结合其他相关线虫的免疫学候选基因研究,筛选出的一种免疫候选基因[17]。生物信息学分析表明,斯氏副柔线虫Pj-CPR基因编码产物注释功能为半胱氨酸蛋白酶,是一种具有信号肽序列的分泌蛋白。蛋白跨膜区预测和蛋白亚细胞定位分析表明,该蛋白属非跨膜蛋白,主要位于胞外;抗原表位预测有5个抗原表位,具有较好的抗原性。通过生物信息学分析,斯氏副柔线虫Pj-CPR基因符合寄生虫免疫学诊断和免疫防控候选基因的特点。
本研究从斯氏副柔线虫中克隆了Pj-CPR基因并构建了该基因的原核表达载体,测序结果表明克隆的基因与转录组测序结果一致,成功构建了该基因的原核表达载体。原核表达载体转入大肠埃希菌BL21(DE3)后,以IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明,与BL21(DE3)空菌和含有pET30a(+)空载体的BL21(pET30a)相比,获得了预期大小的重组蛋白表达。Westernblot结果证实了重组Pj-CPR蛋白能够与感染斯氏副柔线虫的骆驼血清中的抗体特异性结合,而与未感染斯氏副柔线虫的骆驼血清不发生反应,说明所获得的重组蛋白为斯氏副柔线虫Pj-CPR基因重组蛋白,该基因编码产物,在自然感过程中能够刺激宿主产生特异性抗体。由于该基因在GenBank中与常见反刍动物寄生虫基因比较为该病原特有基因,是一种具有重要生物功能的蛋白酶,所以该基因可以作为斯氏副柔线虫的免疫学诊断和防控的候选基因。研究结果可为家畜,特别是骆驼斯氏副柔线虫相关研究奠定基础。
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