摘要：建立了一种新型的聚合物整体柱制备方法，将四羧基钴酞菁（ＣｏＰｃＴｃ）引入聚（甲基丙烯酸缩水甘油酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯）（Ｐｏｌｙ（ＧＭＡ-ＥＤＭＡ））整体柱，用于转铁蛋白糖肽的富集。由于四羧基钴酞菁和糖肽之间的氢键和金属配位作用，制备的整体材料在用于糖肽富集时具有高效性和选择性。转铁蛋白经过功能化整体柱富集后，通过电喷雾四极杆飞行时间质谱分析，共捕获到17条糖肽。当转铁蛋白浓度降至8.8×10-10ｍｏｌ／Ｌ时，仍然可以得到3条糖肽，说明合成的聚合物整体材料对微量蛋白样品分析具有很高的应用潜力。
关键词：制备,聚合物整体柱,富集,酞菁,转铁蛋白
蛋白质糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式，普遍存在于哺乳动物细胞中，对蛋白质的功能、结构有着重要影响，并在许多生理和病理过程中发挥着至关重要的作用。大量研究表明糖蛋白可以作为多种疾病的生物标记物［1，2］。质谱是分析蛋白质糖基化的强大工具，但大多数糖蛋白是低丰度蛋白质，难以达到质谱的灵敏度或存在质谱分析电离效率较差等问题［3］。因此，对复杂样本中的糖蛋白进行有效富集分离是实现高效糖蛋白鉴定的必要前提。常见的糖蛋白或糖肽富集策略包括凝集素亲和层析法［4］、硼酸亲和富集法［5］、肼化学富集法［6］和亲水作用色谱法［7］。由于聚合物整体柱具有渗透性高、稳定性高、传质速度快等优势［8］，已被成功用于糖蛋白或糖肽的富集。为了提高富集选择性，通常对聚合物整体材料进行改性，改性材料包括金纳米粒子［9］、氧化石墨烯［10］和硼酸［11］等。
酞菁（Ｐｃｓ）是一种具有18个π电子的大共轭体系化合物，由4个异吲哚亚基通过氮原子连接在一起［12］。酞菁分子环内有一个空穴，可以与70余种金属离子形成金属酞菁（ＭＰｃ）［13］。金属酞菁及其衍生物已广泛应用于电化学传感［14］、气体传感［15］和光动力治疗药物［16］等。在酞菁环外周或者轴向位置引入各种取代基可以提高其在水和有机溶剂中的溶解度［17］。金属酞菁配合物可以和不同的分析物通过中心金属配位作用、π-π相互作用、氢键和范德华力结合［18］。Ｙｕ等［19］通过铜酞菁和功能单体之间的氢键作用合成了铜酞菁分子印迹聚合物，成功用于腐殖酸中酞菁类似物的分离；Ｃａｎｄｉａｎｏ等［20］证实阿尔新蓝（具有外周取代酞菁结构的典型染料）能够特异性结合糖蛋白和糖胺聚糖。尽管酞菁在糖肽分离富集方面具有潜在能力［21］，但根据文献调查表明，很少有研究报道酞菁在分离领域中的应用。
转铁蛋白（Ｔｆ）是血浆中主要结合并转运铁的糖蛋白，分子质量约为80ｋＤａ，主要负责运载由胃肠道吸收的铁和由红细胞降解释放的铁［22］。在本工作中，将四羧基酞菁钴（ＣｏＰｃＴｃ）引入聚（甲基丙烯酸缩水甘油酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯）（ＧＭＡ-ＥＤＭＡ）整体柱，作为聚合物整体柱微萃取（ＰＭＭＥ）［23］的材料，并结合电喷雾四极杆飞行时间质谱（ＥＳＩ-Ｑ-ＴＯＦＭＳ）用于转铁蛋白糖肽的富集，并证明其具有很高的糖肽富集选择性。
1实验部分
1．1仪器、试剂与材料
Ｎｉｃｏｌｅｔｉｓ5型傅里叶变换红外光谱仪（ＦＴ-ＩＲ，ＴｈｅｒｍｏＮｉｃｏｌｅｔ公司，美国）；ｍｉｃｒｏＴＯＦ-ＱⅡ型电喷雾四极杆飞行时间质谱（ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓ公司，美国）；ＤＦ-101Ｓ型集热式恒温加热磁力搅拌器（上海羌强实业发展有限公司）；ＬＳＰ01-1Ａ型注射泵（保定兰格恒流泵有限公司）。
ＧＭＡ、ＥＤＭＡ、Ｔｆ（纯度≥98％）、牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、二硫苏糖醇、碘乙酰胺和胰蛋白酶（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ公司，美国）；环己醇、月桂醇、乙二胺、3（甲-基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（γ-ＭＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ′-二环己基碳二亚胺（ＤＣＣ）和尿素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；丙酮、氢氧化钠（ＮａＯＨ）、盐酸（ＨＣｌ）、乙腈（ＡＣＮ）、甲醇、偶氮二异丁腈（ＡＩＢＮ）、Ｎ，Ｎ-二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）、甲酸（ＦＡ）和碳酸氢铵（天津光复精细化工研究所）；六水合氯化钴（ＣｏＣｌ2·6Ｈ2Ｏ）、钼酸铵（（ＮＨ4）2Ｍｏ2Ｏ7）和偏苯三酸酐（郑州阿尔法化工有限公司）；石英毛细管（530μｍ，河北永年光纤厂）。所有试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。
1．2ＣｏＰｃＴｃ的合成
根据参考文献［24，25］制备ＣｏＰｃＴｃ：将充分研磨的1.50ｇ偏苯三酸酐、6.00ｇ尿素、0.06ｇ（ＮＨ4）2Ｍｏ2Ｏ7、1.38ｇＣｏＣｌ2·6Ｈ2Ｏ混合均匀，加入带有回流冷凝和搅拌装置的100ｍＬ烧瓶中，搅拌条件下加热至160℃并保持3ｈ，然后继续升温至230℃反应6ｈ。将得到的固体用沸水洗至滤液无色，再将其用100ｍＬ2ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ溶液在100℃下水解12ｈ，静置、冷却至室温后，过滤，用浓盐酸调节滤液的ｐＨ值至2。静置过夜，过滤并收集沉淀，将得到的产物用大量的水、甲醇、丙酮清洗数次，最后于80℃真空干燥。
1．3聚（ＧＭＡ-ＥＤＭＡ-ＣｏＰｃＴｃ）整体柱的制备
首先根据文献报道［26］对毛细管管壁（20ｃｍ×530μｍ）进行硅烷化处理：依次用丙酮、1ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ、超纯水、1ｍｏｌ／ＬＨＣｌ、水、丙酮各冲洗30ｍｉｎ。将含60％（ｖ／ｖ）γ-ＭＡＰＳ试剂的丙酮溶液注入毛细管中，两端用硅胶密封，置于烘箱中，于55℃加热14ｈ，用丙酮冲洗30ｍｉｎ，再用氮气吹干。
制备聚（ＧＭＡ-ＥＤＭＡ-ＣｏＰｃＴｃ）整体柱包括以下3个步骤：（1）称取适量单体ＧＭＡ（173μＬ）和ＥＤＭＡ（114μＬ）、致孔剂环己醇（655μＬ）和月桂醇（70ｍｇ）以及引发剂ＡＩＢＮ（4ｍｇ），超声30ｍｉｎ，混合均匀，通入氮气10ｍｉｎ除去氧气和气泡。将上述得到的聚合反应液注入处理过的毛细管中，毛细管两端用硅胶密封，于60℃反应24ｈ。反应完成后，将得到的整体柱用甲醇冲洗，去除未反应的单体和致孔剂。（2）将乙二胺溶液以100μＬ／ｍｉｎ的流速通过预先制备的聚（ＧＭＡ-ＥＤＭＡ）整体柱，30ｍｉｎ后将柱两端用硅胶密封，于70℃反应4ｈ［27］。反应完成后，用过量的水冲洗整体柱至中性。（3）将ＣｏＰｃＴｃ（10ｍｇ）超声分散在0.5ｍＬＤＭＦ溶液中，然后加入ＤＣＣ（13.24ｍｇ），搅拌20ｍｉｎ，然后以50μＬ／ｍｉｎ的流速通过氨基修饰的聚（ＧＭＡ-ＥＤＭＡ）整体柱，直至有蓝色溶液流出［28］，然后用硅胶密封柱两端，在室温下反应24ｈ。将得到的聚（ＧＭＡ-ＥＤＭＡ-ＣｏＰｃＴｃ）整体柱分别用甲醇和纯水冲洗。
1．4样品前处理
称取1ｍｇ标准转铁蛋白样品，溶解于1ｍＬ50ｍｍｏｌ／Ｌ碳酸氢铵溶液中，于95℃加热变性10ｍｉｎ，冷却至室温后加入10ｍｍｏｌ／Ｌ二硫苏糖醇，于56℃反应1ｈ，再加入20ｍｍｏｌ／Ｌ碘乙酰胺，在室温下于暗处反应45ｍｉｎ。按照底物：胰蛋白酶=30:1的质量比加入胰蛋白酶，于37℃水浴条件下酶解16ｈ，然后在室温下加入2μＬ甲酸终止反应。酶解液置于-20℃冰箱中保存备用［29］。
牛血清白蛋白和转铁蛋白的混合样品也按照上述方法进行处理。
1．5糖肽富集
将0.3ｍＬ上样溶液（含80％（ｖ／ｖ）ＡＣＮ和0.1％（ｖ／ｖ）ＦＡ的水溶液）以30μＬ／ｍｉｎ的流速推过整体柱（3ｃｍ），然后将0.4ｍＬ转铁蛋白酶解液以10μＬ／ｍｉｎ的流速流经整体柱，再用2ｍＬ上样溶液以50μＬ／ｍｉｎ的流速去除非糖肽。最后用解析液（含50％（ｖ／ｖ）ＡＣＮ和0.1％（ｖ／ｖ）ＦＡ的水溶液）以4μＬ／ｍｉｎ的流速推过整体柱，收集解析液10ｍｉｎ，将得到的解析液通过质谱分析。
1．6质谱条件
离子源：电喷雾电离源，正离子模式（ＥＳＩ+）；离子源温度：110℃；电喷雾电压：2.3ｋＶ；扫描范围：ｍ／ｚ800~2000；毛细管电压：3500Ｖ；碰撞解离能量：10ｅＶ；去溶剂气体：氮气；去溶剂温度：200℃；去溶剂气体流速：8Ｌ／ｍｉｎ。
2结果与讨论
2．1ＣｏＰｃＴｃ加入量的选择
聚（ＧＭＡ-ＥＤＭＡ）整体柱具有均一多孔的结构，有利于快速传质。当在聚合液中加入ＣｏＰｃＴｃ的含量为5ｍｇ或10ｍｇ时，整体柱的多孔结构依然存在；当ＣｏＰｃＴｃ的加入量超过15ｍｇ时，用甲醇溶液冲洗时，发现整体柱的通透性变差。因此后续实验中采用加入10ｍｇＣｏＰｃＴｃ制备的聚（ＧＭＡ-ＥＤＭＡ-ＣｏＰｃＴｃ）整体柱。
2．2聚（ＧＭＡ-ＥＤＭＡ-ＣｏＰｃＴｃ）整体柱的表征
ＣｏＰｃＴｃ、聚（ＧＭＡ-ＥＤＭＡ）整体柱和聚（ＧＭＡ-ＥＤＭＡ-ＣｏＰｃＴｃ）整体柱的红外光谱图见图1。如图1ａ所示，1150、1092、944和739ｃｍ-1处的吸收峰为酞菁化合物的特征吸收峰，说明形成了酞菁大环结构［30］；3430ｃｍ-1处的吸收峰属于-ＯＨ的伸缩振动吸收峰；1664和1332ｃｍ-1处的吸收峰属于Ｃ=Ｏ伸缩振动峰和Ｃ-Ｏ伸缩振动峰，证明合成的酞菁分子中含有羧基基团。如图1ｂ所示，1740ｃｍ-1处的吸收峰属于ＧＭＡ和ＥＤＭＡ分子上的Ｃ=Ｏ伸缩振动峰；图1ｃ中新出现的1652ｃｍ-1处的吸收峰为整体柱上酰胺键的特征峰［31］，证明ＣｏＰｃＴｃ已经成功键合在聚（ＧＭＡ-ＥＤＭＡ）整体柱上。
2．3聚（ＧＭＡ-ＥＤＭＡ-ＣｏＰｃＴｃ）整体柱对转铁蛋白糖肽的富集
考察了聚（ＧＭＡ-ＥＤＭＡ）整体柱和聚（ＧＭＡ-ＥＤＭＡ-ＣｏＰｃＴｃ）整体柱对转铁蛋白酶解液中糖肽的富集性能。在富集前，由于非糖肽的质谱信号较强，抑制了糖肽的信号，只能得到4条糖肽。经过聚（ＧＭＡ-ＥＤＭＡ）整体柱和氨基修饰的聚（ＧＭＡ-ＥＤＭＡ）整体柱富集后，分别可以得到6条和7条糖肽，但是糖肽信号依然较弱。然而，经过聚（ＧＭＡ-ＥＤＭＡ-ＣｏＰｃＴｃ）整体柱富集后，非糖肽的信号几乎已经消除，原本非常微弱的糖肽信号的峰强度有显著增强，共检测到17个糖肽信号，且发现多个富集前未能检测到的糖肽信号峰，具体的氨基酸序列见表1。ＣｏＰｃＴｃ能够提高对糖肽的富集能力，这主要是由于ＣｏＰｃＴｃ的钴原子能够和肽段之间产生配位作用，更重要的是ＣｏＰｃＴｃ结构中异吲哚基上的氮基团可以和糖肽形成氢键作用［20］，从而提高了富集选择性。为进一步说明聚（ＧＭＡ-ＥＤＭＡ-ＣｏＰｃＴｃ整体柱对糖肽的富集选择性，用质量比为1000:1的牛血清白蛋白和转铁蛋白的混合物作为样品进行分析，富集前后分别得到2个和6个糖肽信号（见表1）。证明修饰的整体材料具有抗非糖肽信号干扰的能力。
3结论
本文将ＣｏＰｃＴｃ引入到聚（ＧＭＡ-ＥＤＭＡ）整体柱中，制备了新型的聚（ＧＭＡ-ＥＤＭＡ-ＣｏＰｃＴｃ）整体柱，建立了一种ＰＭＭＥ-ＥＳＩ-Ｑ-ＴＯＦＭＳ的方法，成功用于转铁蛋白糖肽的富集。ＣｏＰｃＴｃ和糖肽之间的配位和氢键作用增强了糖肽的富集效率和选择性。本工作不仅提供了一种新的高效富集糖肽的材料，还进一步开拓了金属酞菁的应用领域。
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