杏仁核作为边缘系统的重要组成部分,与情绪异常的精神疾病相关,而杏仁中央核和基底核在恐惧条件化、动机奖赏、药物成瘾以及颞叶癫痫等疾病中起到重要作用。神经连接是神经元行使功能的生理学基础,近年来嗜神经病毒已经成为方便有效的神经环路示踪技术。本文采用一种新型的狂犬病毒RV,该病毒是一种嗜神经病毒,能在神经中逆向传导,且不跨突触。将该病毒注射到杏仁中央核,７d后取脑组织进行切片观察,发现病毒标记到杏仁核区域,如纹状体、杏仁核基底核、外侧核、前端杏仁核背侧、杏仁核纹状体过渡区,以及皮层各区域。此外还包括丘脑和下丘脑的某些区域。本文研究证明杏仁中央核接收来自很多脑区的广泛、直接的纤维输入,研究结果对于后续杏仁中央核的功能研究具有重要的参考价值。
杏仁核是公认与情绪相关的核团,也是参与认知和学习记忆的“中枢核团”,其在多种神经精神疾病如抑郁症、焦虑症、创伤后应激等病理过程中扮演重要的角色[１-３]。以往的研究中,基底外侧杏仁核(basolateralnucleusofamygdala,BLA)由于在情绪调控及恐惧相关的情绪记忆中的广泛研究,人们对它的功能有了比较全面的了解[４]。杏仁中央核(centralnucleusoftheamygdala,CeA)是位于颞叶的核团,过去被认为是表达情感和相应生理学反应的重要输出脑区,通过杏仁中央核的内侧亚基与脑干区域的投射来调控具体的行为和生理反应。而最新的研究表明,杏仁中央核在动机、摄食等情绪反应中起到重要作用[５],表明该核团的更多功能长久以来并没有得到全面的阐述。在基础的神经连接方面,杏仁中央核的神经纤维输入和输出的研究也没有全面而系统的文献指导。通过综合已有的零散研究发现,杏仁中央核接受终纹床核[６]、下丘脑室旁核[７]、杏仁基底核、杏仁外侧核、杏仁基底核前部[８-１０]、丘脑中央核[１１]和皮层区域(包括导叶皮层、前边缘皮层、鼻周皮层、杏仁核－梨状核过渡区[１２]等)的投射。这些研究主要是通过在目标脑区注射菜豆白细胞凝集素(phaseolusvulgarisleucoagglutinin,PHAL)观察顺向投射到CeA区得到的。综上所述,关于CeA纤维输入的研究相对较少。
随着神经连接技术的进步,嗜神经病毒示踪目前已经成为主流的神经环路示踪技术之一。狂犬病毒(rabiesvirus,RV)是一种子弹状的单链RNA病毒,属于弹状病毒科(Rhabdoviridae),病毒粒子的直径约８０nm,长度约１７０nm。病毒基因组的长度约１１．９kb,包含５个基因,分别编码核蛋白(nucleoprotein,N)、磷酸化蛋白(phosphoprotein,P)、糖蛋白(glycoprotein,G)、基质蛋白(matrixprotein,M)和聚合酶(polymerase,L)。该病毒利用自身编码RNA聚合酶且不需要进入宿主细胞核便可完成RNA的复制,形成新的病毒颗粒[１３]。野生的RV本身因具有沿轴突逆向传播感染神经元的特性,为逆向标记神经环路的理想工具,但其具有的剧烈毒性又使研究者们不得不设法对其进行改造。Wickersham等在狂犬疫苗SADB１９毒株的基础上,删除其自身糖蛋白基因G,替换为荧光蛋白基因,将其改造成为了优秀的不跨突触的逆向标记神经环路的工具[１４](图１):即只能在初次感染的神经元中复制而无法再次感染下一级神经元,所以毒性降低,被感染的实验动物能够长期存活,而被标记的神经元内荧光蛋白表达量很高,可以清晰地观察到神经元的很多细节,如树突棘等。
为了全面了解杏仁中央核的纤维输入,以及推测其在情绪相关的行为、成瘾以及奖励机制和动机行为中的作用,本文采用一种较新的RV病毒示踪技术研究杏仁中央核的逆向投射,将为进一步研究杏仁中央核的功能,以及在疾病中的作用提供参考。
１材料与方法
１．１实验材料和仪器６只雄性C５７BL/６小鼠,６~８周龄,体质量２５~３０g,SPF级(全部购自北京维通利华实验动物技术有限公司,生产许可证号:SCXK(京)２０１２-０００１);RV病毒(中国科学院武汉物理与数学研究所徐富强课题组提供);明胶(上海生工);多聚甲醛(sigma);水合氯醛(科密欧);冰冻切片包埋剂OCT(LEICA);生物安全柜(ThermoScientific,１３００);荧光显微镜(Nicon,Ti-E);小鼠脑立体定位仪(瑞沃德,６８００１);电动微量注射泵(Harvard,PHD２２２０００Nanomite);玻璃电极控制仪(Sutter,P-９７);微型手持式颅钻(SAESHIN,STRONG２０４);冰冻切片机(LEICA,CM１９５０)。
１．２脑立体定位注射病毒
１．２．１固定
小鼠称体质量,按体质量０．１mL/１０g注射５０mg/L水合氯醛溶液麻醉后,固定在小鼠脑立体定位仪上。用红霉素眼膏覆盖小鼠眼球,将立体定位仪上的夹持器夹住钢针轻触颅骨表面,同时调整耳杆和齿杆的高度,使小鼠颅骨顶面基本保持水平。
１．２．２定位开颅
把钢针移至前囟点,将三维电子标尺全部归零后,将钢针按照校正后的坐标移至前囟向后１．０６mm,中线向左２．７５mm处。钢针轻触颅骨表面留下标记,用微型手持式颅钻,在颅骨标记处打开一个直径约１．５mm的窗口。打开颅骨时,不要损伤硬脑膜,窗口处时常滴加生理盐水保持湿润。
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